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引言

急性心肌梗死具有发病迅速且死亡率高的特点，且疾病早期缺少特征性的临床表现。因此，通过检测疾病标志物（如心脏脂肪酸结合蛋白，H-FABP）以实现心肌梗死的早期预警和快速诊断具有重要的临床意义。目前，H-FABP主要通过酶联免疫分析或乳胶凝集法检测，虽然以上两种方法可以准确定量H-FABP，但需要较复杂的诊断仪器、专业的技术人员和较长的分析检测时间。针对急性心肌梗死发病迅速的特点，发展分析速度快且操作简单的现场快速检测技术具有重要意义。

侧流免疫层析（Lateralflowimmunoassay,LFIA）技术具有成本低、分析速度快、操作简便的优势，是当前现场快速检测（Point-of-caretest,POCT）的主流技术。根据信号探针的不同，商业化的侧流免疫层析可分为以金纳米颗粒为信号探针的比色型LFIA和以荧光基团为信号探针的荧光型LFIA。目标检测物的浓度与金纳米颗粒的颜色强度或荧光探针的荧光强度正相关，故可通过裸眼定性检测目标物。但受限于信号强度，以上两种方法均无法实现低浓度目标物的准确定量检测，且单一的信号探针易受环境因素（如光散射、光漂白等）的影响，进一步影响检测结果的准确性。

以两种不同颜色的荧光探针为基础可以构建比率型荧光检测方法。不仅能够以一种荧光探针为内标，减少外界环境因素对检测结果的影响；还能通过改变两种探针的信号强度比输出不同的颜色。由于人眼对颜色变化更敏感，比率型荧光检测可以极大地提高目视比色法的检测灵敏度。因此，发展比率型荧光侧流免疫层析技术有望弥补传统方法在信号强度和检测灵敏度上的不足，进而实现急性心肌梗死的快速、准确诊断。

成果简介

浙江工业大学化学工程学院的胡军教授及黄亮研究员与浙江大学化学系的苏彬教授合作在《AngewandteChemieInternationalEdition》期刊上发表了题为“RatiometricFluorescentLateralFlowImmunoassayforPoint-of-CareTestingofAcuteMyocardialInfarction”的研究论文。在这项研究中，作者使用两种不同颜色的量子点构建了可用于急性心肌梗死快检的比率型荧光侧流免疫层析试纸条。绿色量子点与捕获抗体相连并固定在试纸条的检测线（T线）处，红色量子点与金纳米颗粒组成复合发光体SAQ并修饰在检测抗体上，当体系中存在目标检测物时，红色的SAQ被捕获抗体捕获，试纸条的T线处同时存在红色和绿色的荧光探针。因此，与使用单一荧光探针的免疫层析试纸条（FLFIA，示意图1）不同，该工作发展的比率型荧光免疫层析试纸条（RFLFIA，示意图1）随样本中目标检测物浓度的升高会出现绿色至红色的颜色变化，通过目视比色法即可实现目标检测物——心源性脂肪酸结合蛋白（H-FABP）的半定量检测，从而实现急性心肌梗死的现场快速检测。进一步地，作者以智能手机为基础开发了与试纸条搭配的成像和数据处理设备，使用智能手机的摄像头拍摄试纸条的荧光图像，并通过内置的色度分析软件给出目标检测物的定量结果，检测限可至0.21ng/mL。

示意图1：比率型荧光侧流免疫层析（RFLFIA）与传统荧光侧流免疫层析（FLFIA）对比。

图文解读

图1用于比率型免疫层析的两种荧光探针（SAQ和gQD）的合成。

SAQ和gQD是比率型免疫层析中使用的两种荧光探针。其中，SAQ通过在SiO2纳米颗粒中装载金纳米颗粒和红色的CdSe/CdS/ZnS量子点得到。如图1所示，作者首先使用巯基硅烷处理树枝状SiO2纳米颗粒（dSiO2），并通过Au-S键结合直径约11nm的金纳米颗粒（AuNPs），装载完毕后进一步硅烷化处理以封闭孔道，防止AuNPs脱落。随后，使用相同的步骤装载红色的量子点（rQDs），最后经表面羧基官能团化以便于后续偶联抗体。对于绿色的量子点（gQD）来说，作者首先购买了疏水性的CdZnSe/CdS/ZnS量子点，随后通过表面包覆两亲性聚合物PMAQ将量子点转移至水相。

图2SAQ中金纳米颗粒对gQD的荧光内滤效应。

为进一步增强红色的量子点与绿色的gQD结合后的颜色变化，作者将金纳米颗粒与红色量子点结合在一起共同组成SAQ，通过金纳米颗粒的内滤效应降低gQD的绿色荧光背景。图2a对比了gQD的吸收（绿色虚线I）、荧光（绿色实线II）光谱以及金纳米颗粒（紫色虚线III）和SAQ（红色虚线IV）的吸收光谱。由以上结果可知，金纳米颗粒的吸收光谱与gQD的发射光谱有大范围重叠，SAQ与gQD结合后gQD的荧光可被SAQ中的金纳米颗粒吸收，从而降低绿色荧光背景。由图2b可知，gQD与SAQ结合后其荧光信号明显降低。图2c-d对比了阴性（图2c）和阳性（图2d）实验时试纸条在日光（i）、紫外光（ii）下的照片和扫描电子显微镜（SEM）照片（iii），不难看出，当样本中不含目标检测物时，试纸条的T线不会结合SAQ，故日光下不能看到红色的金纳米颗粒条带，紫外光激发下仅观察到gQD的绿色荧光（图2c）；而当样本中含有目标检测物时，SAQ与gQD结合，试纸条T线在日光下呈现出胶体金的红色条带，紫外光激发下呈红色荧光（图2d）。

图3基于智能手机的便携式荧光检测设备及检测结果。

作者进一步开发了基于智能手机的便携式荧光检测设备。该设备由智能手机作为图像采集和处理装置，包括内置电池、nmLED激发光源和相应波长的带通滤光片，可方便地拍摄并分析试纸条的荧光图像（图3a）。如图3b所示，随着目标抗原H-FABP浓度的升高，本工作构建的比率型荧光侧流免疫层析（RFLFIA）可呈现T线上由绿至红的颜色变化，而采用单一荧光探针的FLFIA仅能呈现单一颜色的荧光强度变化，且在低抗原浓度时信号较弱。图c-h进一步对比了RFLFIA（图3c-e）和FLFIA（图3f-h）对目标抗原的定量检测结果，由于RFLFIA含有两种不同颜色的荧光探针，色度分析时可用R（Red）和G（Green）的比值与目标抗原浓度相对应，检测限可至0.21ng/mL；而FLFIA仅能以R值对应抗原浓度，检测限仅为0.59ng/mL。

图4比率型荧光侧流免疫层析试纸条的特异性和准确性。

作者研究了该免疫层析试纸条的特异性，并与商业化的检测方法对比以验证其检测结果的准确性。首先，作者选取了5种其它抗原（cTnl、NT-proBNP、Myo、CRP和HSA）作为特异性检测的对照组，结果显示，仅H-FABP能够产生阳性检测结果（图4a-c）。随后，对比了RFLFIA和商业化的乳胶凝集法对30例样本的检测结果，当抗原浓度在2.5至42.9ng/mL之间时，两种方法的定量检测结果线性相关，说明RFLFIA具有与现有商业化检测方法相当的准确性，但RFLFIA操作简便且检测速度更快，在急性心肌梗死的现场快速检测方面更具应用优势。

图5比率型荧光侧流免疫层析试纸条用于实际样本检测。

由图3b可知，当目标检测物H-FABP的浓度由0ng/mL提升至12.5ng/mL时，比率型荧光试纸条呈现出由绿变黄再到红色的颜色变化。由于心肌损伤的诊断标准为H-FABP浓度大于6.2ng/mL，处于荧光变色的浓度区间内，因此，比率型荧光侧流免疫层析试纸条还可通过目视比色法实现急性心肌梗死标志物的半定量检测，从而实现疾病的快速诊断。如图5a所示，6种不同浓度的H-FABP呈现出不同的荧光颜色，与标准比色卡对照即可半定量H-FABP的浓度。为验证目视比色法的准确性，上述6种样本的荧光图像由11名志愿者根据标准比色卡判断相应的H-FABP浓度且重复3次，其结果如图5b所示。可以看出，志愿者根据标准比色卡判断的目标物浓度与样本中的真实浓度基本一致，准确率在72.7%至97.0%之间。

总结与展望

本文构建了一种比率型荧光侧流免疫层析试纸条用于急性心肌梗死标志物的现场快速定量检测，随着样本中目标检测物浓度的升高，试纸条呈现由绿色至红色的颜色变化，既能通过目视比色法半定量目标物，也能通过作者自行搭建的便携式分析检测装置由色度分析准确定量目标物的浓度。本论文的研究成果有望进一步推动侧流免疫层析技术在现场快速检测和体外诊断领域的应用。

文献链接

RatiometricFluorescentLateralFlowImmunoassayforPoint-of-CareTestingofAcuteMyocardialInfarction；

Angew.Chem.Int.Ed.,60,–

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